La localidad tuvo sus orígenes por obra de don Pedro de Agreda en 1551 y llegó a ella en 1542 el conquistador Hernán Pérez de Quesada, quien, con sus tropas diezmadas y casi vencido por las adversidades que había tenido que padecer en su alocada travesía en la búsqueda de El Dorado, por las tierras del Alto Llano y de la Alta Amazonía, para descansar y recuperarse antes de continuar su viaje hacia la ciudad de Pasto. 

El 29 de septiembre de 1563, el capitán Gonzalo H. p de Avendaño, sobre la margen izquierda del R​ío Mocoa, fundó oficialmente la ciudad con 10 vecinos encomenderos y 800 indígenas, dándole el nombre de San Miguel de Agreda 1 de Mocoa. Por falta de comunicaciones, la ciudad no tuvo gran movimiento y tendió a estancarse; en 1582, dependía en lo civil del Gobernador de Popayán y en lo eclesiástico del obispo de Quito. 

En varias ocasiones el poblado fue atacado por los temibles indígenas Andaquíes, quienes lo incendiaron casi por completo en 1683 y además, sublevaron a los Indios. Esos acontecimientos determinaron que la población fuera trasladada de su lugar de fundación al sitio, entre los ríos Mocoa, y Mulato, en donde se encuentra actualmente. Para 1876, Mocoa era centro de comercio de Quina, Caucho, sal del Brasil y Zarzaparrilla; Al caer el valor de la quina y el caucho la mayoría de los pobladores blancos abandonaron el pueblo, y después varios incendios destruyeron la población, debiendo ser reconstruida. 

En 1958 la localidad fue elevada a la categoría de Municipio y al ser creada en 1968 la intendencia de Putumayo, pasó a ser la capital de la nueva División Político Administrativa, característica que conservo al ser elegido el Departamento del Putumayo en 1991.​